近年來，我國IVD產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，國內(nèi)市場(chǎng)容量向千億元級(jí)邁進(jìn)。
分子診斷作為體外診斷（IVD）領(lǐng)域發(fā)展很快的細(xì)分行業(yè)，具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度更高、特異性更強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于傳染性疾病、血液篩查、遺傳性疾病、腫瘤伴隨診斷等領(lǐng)域。
1、分子診斷技術(shù)
分子診斷是指以DNA和RNA核酸為診斷材料，使用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)人體是否攜帶病毒基因、是否存在缺陷基因以及是否存在表達(dá)異常。 分子診斷是預(yù)測(cè)診斷的主要方法，既可以實(shí)現(xiàn)個(gè)體遺傳病的診斷，又可以實(shí)現(xiàn)腫瘤早篩。
分子診斷大致可分為PCR技術(shù)、基因測(cè)序、熒光原位雜交和基因芯片等。
圖1：分子診斷技術(shù)的分類
目前國內(nèi)分子診斷細(xì)分賽道市場(chǎng)份額占比分別為：PCR(40%)，分子雜交（35%），生物芯片（16%），其他（9%），PCR技術(shù)占據(jù)了分子診斷半壁江山。
（根據(jù)智研咨詢/國元證券研究中心數(shù)據(jù)調(diào)研）
肆虐全球的新冠疫情是分子診斷行業(yè)發(fā)展的催化劑，而PCR技術(shù)是分子診斷中很常用的檢測(cè)手段，作為確診新冠的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
2、PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
PCR（Ploymerase chain reaction）,即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，一種核酸（DNA或RNA）體外擴(kuò)增技術(shù)。利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，能在短時(shí)間內(nèi)將及微量的特定核酸片段復(fù)制出百萬份的拷貝，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)極其微量的DNA或RNA片段進(jìn)行定量。
圖2：PCR反應(yīng)過程
PCR技術(shù)由1983年Kary Mullis首創(chuàng)，被廣泛運(yùn)用在產(chǎn)前診斷（如乙肝病毒篩查）、腫瘤早篩（如HPV人乳頭瘤病毒檢測(cè)）、傳染病檢測(cè)（如HIV艾滋病病毒檢測(cè)）、呼吸疾病檢測(cè)（新型冠狀病毒）基因檢測(cè)(如親子鑒定)等診斷。
圖3：核酸檢測(cè)案例
體外診斷RT-PCR試劑盒中包含了模板雙鏈DNA、一對(duì)特定序列的引物、一個(gè)帶有檢測(cè)基因的探針、DNA聚合酶、底物dNTP、緩沖溶液等，那么如何確保DNA能順利進(jìn)行特異性擴(kuò)增？又如何正常標(biāo)記？引物和探針的寡核苷酸原料必不可少。
圖4：PCR反應(yīng)試劑原料
引物和探針的寡核苷酸原料必不可少。
上文提及的引物、探針，和酶等都是IVD原料，即用于制備IVD產(chǎn)品的材料，其品質(zhì)對(duì)IVD產(chǎn)品的性能和檢測(cè)準(zhǔn)確度影響極大，因此上游環(huán)節(jié)在IVD產(chǎn)業(yè)鏈中話語權(quán)極強(qiáng)。
然而，長(zhǎng)期以來IVD原料生產(chǎn)一直是我國IVD產(chǎn)業(yè)中的卡脖子環(huán)節(jié)。IVD原料市場(chǎng)需求不斷增長(zhǎng)，但其背后的核心技術(shù)并未取得相同幅度的進(jìn)步。由于IVD原料的研發(fā)難度較高，國產(chǎn)IVD原料在生產(chǎn)工藝及純度質(zhì)量上仍與進(jìn)口原料存有差距。
隨著我國IVD原料企業(yè)投入大量資金開展基礎(chǔ)研究與開發(fā)工作，其研發(fā)創(chuàng)新能力與原料工藝質(zhì)量不斷提升。那么我們先來了解一下，生產(chǎn)這些上游原料的要點(diǎn)及難點(diǎn)。
引物
引物的特異性是PCR特異性的關(guān)鍵，引物是具有獨(dú)特靶向序列的短鏈寡核苷酸片段，幫助識(shí)別基因組的獨(dú)特性。通過引物特異性結(jié)合在目標(biāo)區(qū)域，作為DNA復(fù)制開始時(shí)DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)。不純的引物不但會(huì)直接影響RT-PCR的特異性和定量不準(zhǔn)，還會(huì)影響后續(xù)的測(cè)序?qū)嶒?yàn)。
引物不純可能會(huì)導(dǎo)致：
1)非特異性擴(kuò)增；
2)無法用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物5′端酶切位點(diǎn)的酶切開，特別是沒有保護(hù)堿基的引物；
3) 用于測(cè)序出現(xiàn)雙峰或亂峰。
圖5：引物
探針
TaqMan熒光探針是一種具有熒光基團(tuán)的特定寡核苷酸片段，通過檢測(cè)熒光分子的信號(hào)強(qiáng)度即可知道PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量，每擴(kuò)增一條DNA子鏈，就有一個(gè)熒光分子發(fā)出信號(hào)。
圖6：Taqman探針
無論是PCR反應(yīng)還是NGS測(cè)序等核酸水平的分子診斷技術(shù)，都需要優(yōu)質(zhì)的引物和探針，確保診斷的靈敏度和準(zhǔn)確性。必須對(duì)合成后的寡核苷酸片段進(jìn)行純化處理，得到符合純度要求的PCR試劑盒的原料，再銷售至下游生產(chǎn)核酸試劑盒的廠家。
3、如何得到優(yōu)質(zhì)或高純度的引物探針？
引物/探針等寡核苷酸通過自動(dòng)核酸合成儀合成之后，需要通過不同的分離純化方式（比如脫鹽過柱法或RP-HPLC方法）。
圖7：HPLC純化
RP-HPLC制備型反向高效液相色譜法是引物/探針常用的純化方法之一，其優(yōu)點(diǎn)是純度高（高達(dá)99%）、自動(dòng)化程度高。純化后需要使用相關(guān)的溶劑蒸發(fā)設(shè)備去除其有機(jī)溶劑（如乙腈、甲醇、水等）后，一般包裝至EP管或者96孔板中。
然而，使用傳統(tǒng)濃縮方法去除這些溶劑時(shí)，如果控制不當(dāng)，未必能使溶劑蒸發(fā)完全，會(huì)影響引物和探針的一致性和純度。
為防止樣品暴沸，需要在溶劑蒸發(fā)過程的控制好抽真空速率，Genevac大容量核酸合成濃縮儀（圖7）利用控制真空度和離心力，可以有效防止暴沸避免交叉污染。
圖8：真空離心濃縮儀
4、爭(zhēng)分奪秒|分子診斷的新趨勢(shì)
隨著核酸檢測(cè)常態(tài)化發(fā)展，大量的新冠試劑盒被用于每日的核酸檢測(cè)。分子診斷新趨勢(shì)是更快，更準(zhǔn)！
采樣快速——5月9日，國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制提出，大城市要建立步行15分鐘核酸“采樣圈”。
檢測(cè)快速——截至5月12日，上海市的核酸檢測(cè)能力現(xiàn)在也達(dá)到了每天800萬管以上。
(數(shù)據(jù)來源：央視新聞)
5、為上海市復(fù)工復(fù)產(chǎn)做準(zhǔn)備
按照六月以后復(fù)工復(fù)產(chǎn)的要求，每人每周需要進(jìn)行兩次的核酸檢測(cè)，根據(jù)上海市常住人口數(shù)量2500萬，除去退休人員，小孩子，無業(yè)人員，至少有60%的人員需要參加這些檢測(cè)，也就是說每天至少消耗越428萬管的檢測(cè)試劑。
面對(duì)日均如此大需求量的檢測(cè)試劑盒，上游原材料的質(zhì)量和供應(yīng)速度應(yīng)該同幅度進(jìn)步和增長(zhǎng)，在引物和探針的制備過程中，使用高通量的真空離心濃縮設(shè)備可以大幅度提高生產(chǎn)效率，溶劑蒸發(fā)的速度起到四兩撥千斤的作用。
接下來介紹一款大容量核酸合成濃縮儀miVac Quattro，它的樣品通量是傳統(tǒng)的氮吹濃縮儀的5倍+，大幅度提高了蒸發(fā)容量和節(jié)約蒸發(fā)時(shí)間。在核酸合成中常用的1.5ml EP管可以同時(shí)濃縮200位樣品，另外兼容96孔板，最多可同時(shí)容納20個(gè)淺孔微孔板或8個(gè)深孔板。
圖9：miVac Quattro大容量核酸合成濃縮儀
圖10： 多樣的轉(zhuǎn)子類型
提高濃縮速度的秘訣是提高熱傳導(dǎo)率。
下圖使用不同條件下的樣品濃縮速度，Genevac通過一系列措施促進(jìn)熱量向樣品傳導(dǎo)，在濃縮速度上有顯著提升，助力引物/探針試劑高效率生產(chǎn)。
圖11：不同條件下的提升濃縮速度
①實(shí)心鋁制轉(zhuǎn)子——相比塑料轉(zhuǎn)子或空心轉(zhuǎn)子，獨(dú)特的實(shí)心鋁制轉(zhuǎn)子具有良好的熱傳導(dǎo)效果，即使在真空條件下也能有效傳遞熱量。
②腔體預(yù)熱功能——結(jié)合腔體預(yù)熱功能，能有效提升濃縮速度。
③高效率的SpeedTrap?冷阱——新型的冷阱線圈制冷，能冷凝回收95%以上的有機(jī)溶劑。
圖12：Speedtrap冷阱
一款安全、可控、快速、高通量的濃縮儀，可以更大程度地減輕工作負(fù)擔(dān)，高效助力生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的IDV原料，用戶僅需設(shè)置溫度，一鍵選擇醇或水的方法，然后按下啟動(dòng)鍵即可使用。
寡核苷酸除了在IVD中扮演重要角色，現(xiàn)在作為創(chuàng)新藥的熱門選手，也承載了很多科研人員的希望，下一期我們就來聊聊Oligo藥物篩選的那些事。
原理介紹：
Genevac miVac是由離心腔、冷阱、真空泵三部分組成真空離心濃縮儀，用于對(duì)寡核苷酸、核酸等樣品進(jìn)行濃縮、純化、干燥，適用于oligo合成、RNA/DNA制備、肽制備、測(cè)序、分子生物學(xué)和ADME/毒理學(xué)研究。
抽真空：利用壓力降低時(shí)，溶劑的沸點(diǎn)也隨著降低。使生物樣品能在較低的溫度條件下進(jìn)行溶劑蒸發(fā)。加快蒸發(fā)效率的同時(shí)，可防止熱敏感樣品失活。
離心：為了避免樣品暴沸和交叉污染，采用高速離心旋轉(zhuǎn)技術(shù)，離心力的作用下可以有效防止暴沸和樣品損失，干燥后的溶質(zhì)完全沉積在容器的底部，便于樣品的完全回收。
熱量：加速樣品的蒸發(fā)速率。
英國GeneVac公司成立于1990 年，隸屬SP Scientific 旗下，一直專注于研究和生產(chǎn)各種離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備，不斷為生命科學(xué)提供更前沿和優(yōu)質(zhì)的解決方案。
