之前我們在《干貨分享 | 凍干樣品配方的關(guān)鍵溫度的測量》中，就已經(jīng)聊到過關(guān)鍵溫度對于凍干工藝的重要性。
在冷凍干燥過程中，產(chǎn)品應(yīng)保持在其關(guān)鍵溫度以下，如玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg’），共晶點(diǎn)(Teu)和塌陷溫度(Tc)，以確保一個安全和穩(wěn)健的循環(huán)，并減少產(chǎn)品冷凍干燥后出現(xiàn)的有害缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。缺陷可能包括但不限于產(chǎn)品內(nèi)的物理塌陷或微塌陷、活性喪失和高水分含量。
微塌陷程度是頗具挑戰(zhàn)性的量化缺陷之一，許多配方由于藥物活性喪失而在第一個周期失效。
一、如何量化微塌陷程度？
MicroPress 微壓力凍干餅分析儀
MicroPress 微壓力凍干餅分析儀是一款由Biopharma公司開發(fā)的創(chuàng)新儀器，用于量化低密度材料中的原位微觀缺陷。
例如，甘露醇經(jīng)常用于配方中，它具有較高的關(guān)鍵溫度，可以掩蓋具有明顯較低關(guān)鍵溫度的產(chǎn)品的塌陷。葡萄糖的關(guān)鍵溫度在-41℃左右，當(dāng)與甘露醇結(jié)合時，如果干燥超過關(guān)鍵溫度，就會塌陷。
然而，由于甘露醇的膨脹性，該混合物盡管可能存在結(jié)構(gòu)缺陷，但一旦冷凍干燥，就具有良好的外觀。在保持甘露醇濃度不變的同時，可以通過改變葡萄糖的濃度來確定微塌陷的程度和餅狀結(jié)構(gòu)的影響。通常， 由于高溫，用來冷凍干燥這種溶液的循環(huán)不會使葡萄糖足夠冷凍干燥，因此可能會發(fā)生塌陷。相反，甘露醇會干燥足夠的量來保持蛋糕的結(jié)構(gòu)。然而， 由此產(chǎn)生的，看似不明顯的微觀的塌陷，會影響復(fù)水性，以及藥物本身的穩(wěn)定性和活性。
以下是結(jié)合使用了MicroPress 微壓力凍干餅分析儀的具體實(shí)驗(yàn)方法。
二、具體實(shí)驗(yàn)方法
1、配方溶液制備
樣品溶液的制備方法見表1。所有化學(xué)品均來自Sigma Aldrich。使用6ml西林瓶灌裝2ml。
表1：起始溶液的濃度
2、樣品冷凍干燥
這些小瓶用表2所示的方法冷凍干燥。預(yù)凍讓所有的樣品被冷凍，使晶體尺寸增加，樣品進(jìn)入下一個階段干燥。
在干燥階段，壓力降低，使冰升華，干燥產(chǎn)品。所有樣品都放置在凍干機(jī)的同一個托盤上，以控制干燥過程中的可見變量。
表2：在SP Scientific冷凍干燥機(jī)上使用的凍干工藝
3、MicroPress測量與分析
所有的樣品都在MicroPress上使用相同的一組參數(shù)進(jìn)行分析 ，通過用戶友好的軟件設(shè)計(jì)，參數(shù)很容易設(shè)置，并可以更改以適應(yīng)多種要求。參數(shù)設(shè)置情況見表3。
表3：MicroPress測試階段及相應(yīng)的速度
Extend階段的速度為10mm/s，與估計(jì)的蛋糕高度的距離在5mm以內(nèi)。Seek階段找到蛋糕的頂部，一旦感覺到力，Compress階段開始，然后記錄施加在蛋糕上的力。
4、結(jié)果分析
下表4顯示了從配方分析獲得的結(jié)果。配方1具有最高的楊氏模量，因此是最強(qiáng)的蛋糕。
表4：獲得的3種配方的強(qiáng)度結(jié)果
● 配方1的平均楊氏模量為0.969 kPa，配方1中最強(qiáng)的值為圖1中的橙色。該蛋糕的楊氏模量為1.246 kPa，最大應(yīng)力為17.600 kPa；
● 圖1中的另外兩條曲線分別表示配方2 (灰色) 和配方3 (藍(lán)色) 。配方2的楊氏模量為0.473 kPa，最大應(yīng)力為7 kPa；
● 配方3（藍(lán)色）看似比配方2（灰色）有一個更高的最大應(yīng)力，實(shí)際上真正的最大應(yīng)力在應(yīng)變51%左右，楊氏模量為0.017 kPa，最大應(yīng)力為2.660 kPa，是所有被分析的蛋糕中最弱的。
圖1：使用MicroPress分析的三種配方圖（配方1-橙色，配方2-灰色，配方3-藍(lán)色）
三、關(guān)于實(shí)驗(yàn)的討論
表4中為本次實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)。甘露醇/葡萄糖樣品溶液中的葡萄糖濃度越高，蛋糕的強(qiáng)度就越弱。傳統(tǒng)的甘露醇被用作賦形劑，已知它對許多配方的關(guān)鍵溫度有積極 的影響。然而，這可能掩蓋了一個配方可能具有的一些關(guān)鍵溫度。葡萄糖的塌陷溫度為-41.0℃，當(dāng)甘露醇凍干時，塌陷在甘露醇支架上。這種蛋糕看起來很結(jié)實(shí)， 眼見的外觀良好，但當(dāng)用掃描電鏡或類似的技術(shù)分析時 ，晶格看起來更“濕潤”，孔隙更寬。
當(dāng)用MicroPress分析時，增加葡萄糖濃度對材料強(qiáng)度的影響是很明顯的。蛋糕內(nèi)的葡萄糖越多，物質(zhì)強(qiáng)度就會減弱。當(dāng)使用冷凍干燥顯微鏡(FDM)或差示掃描量熱法(DSC)進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)樣品往往只顯示甘露醇的結(jié)晶和熔化，而甘露醇有著強(qiáng)大的外部結(jié)構(gòu)，掩蓋了葡萄糖的玻璃化轉(zhuǎn)變。
關(guān)鍵溫度分析只揭示了甘露醇的熔化，因此當(dāng)產(chǎn)品凍干保持樣品在-10℃以下，葡萄糖在主體材料中塌陷。因此， 由于葡萄糖的關(guān)鍵溫度較低，甘露醇通常能夠在標(biāo)準(zhǔn)的初級干燥條件下很好地干燥，而葡萄糖則不能。此外，當(dāng)配方中的葡萄糖濃度增加時，蛋糕內(nèi)的微塌陷程度增加，從而產(chǎn)生較弱的蛋糕。在儲存或運(yùn)輸過程中，有微塌陷的材料更容易損壞或減少活性成分。
四、結(jié)論
傳統(tǒng)上，凍干樣品的質(zhì)量是由一些定性技術(shù)來確定的，包括；視覺評估，復(fù)水時間，與參考文獻(xiàn)相比的外在強(qiáng)度，水分含量。然而，這是一種主觀的分析，數(shù)據(jù)的質(zhì)量可能取決于操作者的經(jīng)驗(yàn)。Biopharma公司開發(fā)了這種壓痕技術(shù) ，并將其應(yīng)用于凍干蛋糕，以減少主觀性，并提供凍干產(chǎn)品的定性數(shù)據(jù)，以確定樣品中是否存在產(chǎn)品缺陷。
配方中每個成分的關(guān)鍵溫度與配方的整體關(guān)鍵溫度同樣重要，凍干產(chǎn)品在一個看似安全的溫度會導(dǎo)致弱蛋糕由于凍干期間結(jié)構(gòu)減弱和微塌陷影響蛋糕的強(qiáng)度。
一旦材料被凍干，MicroPress可以用來測試得到的蛋糕的物理特性，以及它們是否在整體強(qiáng)度的所需參數(shù)范圍內(nèi)。在MicroPress上分析的蛋糕還可以使用卡爾-費(fèi)休法測試水分含量， 如果需要玻璃化轉(zhuǎn)變溫度或熔點(diǎn)溫度也可以使用mDSC進(jìn)行測試。
一旦確定了凍干樣品的初始曲線，可以改變配方，增加其它輔料，這可能會影響凍干蛋糕強(qiáng)度。如表4所示，增加材料的濃度并不一定會增加蛋糕的強(qiáng)度。因此，如果在運(yùn)輸過程中發(fā)現(xiàn)蛋糕破裂或破碎的問題，則應(yīng)進(jìn)行輕微的改變，或包含或排除一種或多種輔料可能是有益的。