蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛,是一項重要的操作技術。一個典型的真核細胞可以包含數(shù)以千計的不同蛋白質(zhì),一些含量十分豐富,一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質(zhì),必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來。
蛋白質(zhì)分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟——
01 材料的預處理及細胞破碎
分離提純某一種蛋白質(zhì)時,首先要把蛋白質(zhì)從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài),不喪失活性。所以要采用適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有:
1. 機械破碎法
這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎。常用設備有,高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。
2. 滲透破碎法
這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。
3. 反復凍融法
生物組織經(jīng)凍結(jié)后,細胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。
4. 超聲波法
使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。
5. 酶法
如用溶菌酶破壞微生物細胞等。
02 蛋白質(zhì)的抽提
通常選擇適當?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等),使膜結(jié)構破壞,利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中,應注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質(zhì)的變性。
03 蛋白質(zhì)粗制品的獲得
選用適當?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法:
1. 等電點沉淀法
不同蛋白質(zhì)的等電點不同,可用等電點沉淀法使它們相互分離。
2. 鹽析法
不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì),并能再度溶解而不變性。
3. 有機溶劑沉淀法
中性有機溶劑如乙醇、丙酮,它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低,進而從溶液中沉淀出來,因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。此外,有機溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層,促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質(zhì)變性,使用該法時,要注意在低溫下操作,選擇合適的有機溶劑濃度。
04 樣品的進一步分離純化
用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì),須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有:凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。
05 蛋白質(zhì)的分析測定
通過物理或化學方法對蛋白質(zhì)含量進行測定。蛋白質(zhì)的分析純化,不僅僅是選擇合適的方法,必備的工具,例如微量均質(zhì)器、干燥器、抗體保存盤等,也很重要。
Bel-Art蛋白質(zhì)分析純化工具推薦
本篇我們根據(jù)不同耗材在蛋白質(zhì)分析純化過程中的不同作用,分類為大家推薦幾款合適的耗材。
細胞裂解
熱門優(yōu)選
貨號:F65000-0000
研磨組織和破碎細胞
其他推薦
(Bel-Art 12-除顫樣品勺)
貨號:H36714-0000 & H36718-0000
輕松稱取微量溶菌酶和DNA酶
貨號:F37116-0002
加速細胞裂解
貨號:F18796-0000
貨號:F42011-0000
非常適合在冰箱和-20°C冰箱內(nèi)進行干燥儲存,讓您在需要時保持材料的低溫和無水分
貨號:F19921-0001
貨號:B61506-5100
隨時監(jiān)控實驗溫度
層析
熱門優(yōu)選
磁珠分離架
貨號:F19900-000
分離結(jié)合在磁珠上的蛋白質(zhì)以快速純化
其他推薦
貨號:F37170-0003
Full-View 試管支架
貨號:H18910-0189
貨號:F18745-0000
透析
熱門優(yōu)選
透析袋夾持器
貨號:F18237-0000
其他推薦
貨號:H40260-0000
貨號:H40317-0000
透析管漏斗
貨號:F14848-0000
貨號:F26213-0000
測定
熱門優(yōu)選
貨號:F24976-0001
在進行C14分析時減少接觸
其他推薦
貨號:F24983-0000 & F24984-0000
貨號:F38960-0000
貨號:F37300-0000
貨號:F37310-0000
貨號:F37904-0002
電泳
熱門優(yōu)選
貨號:F37041-0001
提供徹底、溫和的凝膠混合,同時盡可能大限度地擴大實驗室空間
其他推薦
PrepSafe? 微量離心管浮動架
(Bel-Art 13-微量離心管架)
貨號:F18742-0124
貨號:F13554-0000
貨號:F13596-0000
貨號:F45100-0000
貨號:F13551-1000