在蛋白藥物治療的早期研發(fā)中，有必要設計一種在運輸和長期儲存期間穩(wěn)定的配方。顯然，水溶劑的液體產品對于生產來說是很容易且經濟的，對于終端使用者也是十分方便的。

水溶劑的液體產品存在的問題

1. 大多數的蛋白以液體狀態(tài)存在時，易于化學（脫酰胺或氧化）和/或物理降解（聚合，沉淀）;

2. 如果嚴格控制水溶劑蛋白的儲存條件，并且對配方進行合理設計，可以減緩其降解，但是在實際的運輸過程中，精確控制儲存條件通常是行不通的，蛋白會因受到多種應力的作用而變性，包括搖動，高低溫，冷凍等;

3. 盡管會設計配方和運輸條件盡可能規(guī)避這些應力導致的損害，但是仍然不能足夠阻止在長期儲存過程中造成的損害。例如，在某些情況下，盡量減少化學降解的條件會導致物理損傷，反之亦然，那么就無法找到提供必要的長期穩(wěn)定性的折衷條件。

解決方案：凍干配方

設計合理的凍干配方，理論上可以解決以上存在的所有這些問題。在干燥的樣品中，降解反應可以得到充分的抑制或減緩，蛋白產品在室溫狀態(tài)可以仍然維持其穩(wěn)定性，保存期可達到數月或數年的時間。而且，在運輸過程中，短期的溫控偏離，凍干的蛋白樣品通常也不會受到損害。即使在兩種或多種降解途徑需要不同條件才能實現最大熱力學穩(wěn)定性的情況下，干燥產品中反應速率的降低也可以實現長期的穩(wěn)定性。因此，一般來說，當配方前研究表明在液體配方中不能獲得足夠的蛋白穩(wěn)定性時，冷凍干燥提供了頗有吸引力的替代方案。

凍干蛋白配方可能遇到的問題

然而，相對水針劑產品，只需要簡單灌裝即可來說，凍干過程較為復雜，且耗時、成本高，再有，一個十分關心的問題，如果配方中沒有合適的穩(wěn)定賦形劑，大多數蛋白制劑在凍干的過程中至少部分會因凍結應力和脫水應力而變性，結果通常是不可逆的聚合，通常是在凍結之后立即聚合或在儲存過程中，小部分蛋白分子發(fā)生聚合。因為大多數的蛋白藥物是非腸道給藥，即使只有百分之幾的蛋白聚合也是不可以接受的。因此，只是簡單的設計一個配方，允許蛋白能承受凍干過程中的應力，但是無法確保凍干后的樣品能有長期的穩(wěn)定性。一個較差的凍干配方，蛋白很容易發(fā)生反應，須要求在零度以下儲存，這樣的配方應當認為是不成功的。

本文將提供一些實踐的指導，用于配方的設計，可以在凍結和干燥過程中保護蛋白，并且在室溫條件下長期儲存和運輸過程中具有很好的穩(wěn)定性。

再有，會簡要地討論，配方設計須考慮到工藝條件的物理限制，已獲得最終低水分含量的良好蛋糕。我們將不討論凍干工藝的設計和優(yōu)化，也不會偏離關于賦形劑選擇的實用建議，以解決關于這些化合物穩(wěn)定蛋白質的機制的爭論。有豐富經驗的藥物科學家可能跟這篇文章的內容也沒有很大的關系，但是可以將蛋白藥物產品推向市場，然而，我們的目標主要是針對對于穩(wěn)定的凍干蛋白配方設計還不太了解以及具有很大挑戰(zhàn)的那些研發(fā)人員提供一個很好的開始。

當合理設計凍干配方時，需要考慮的因素很多，從整體來看，工作會比較復雜，但如果能很好的理解決定最終成功的主要限制因素，那么就會容易很多。

01蛋白的穩(wěn)定性

首先記住蛋白產品選擇凍干方法的主要原因是其不穩(wěn)定性，整個配方中最敏感的成分也是蛋白質，那么在配方設計中首要關心的是賦形劑的選擇，能夠提供蛋白好的穩(wěn)定性。

02最終藥物配置

在配方研發(fā)開始之前，須確定好最終藥物的配置，需要考慮的問題包括給藥途徑（常為非腸道給藥），共同給藥的其他物質，產品體積，蛋白濃度，凍干盛裝容器（西林瓶、預充針或其它）等，如果最終藥物需要多次使用，在配方中需要加入防腐劑，這個可能會降低蛋白的穩(wěn)定性。

03配方張力

在選擇賦形劑時，可能會考慮設計等張溶液，甘露醇和甘氨酸通常是良好的張力調節(jié)劑，這些賦形劑經常優(yōu)于NaCl,因為NaCl具有較低的共晶融化溫度和玻璃態(tài)轉變溫度，使得凍干更難進行。另外，如果樣品中含有相對低的蛋白量，經常會加入填充劑，避免在凍干的過程中蛋白損失，甘露醇和甘氨酸同時也可以充當這個角色，因為他們會最大程度的結晶并且形成機械強度較高的蛋糕結構。然而，須意識到單獨使用晶體類的賦形劑通常不能夠在凍干過程和儲存期間給蛋白提供足夠的穩(wěn)定性。

04產品的蛋糕結構

最終凍干的樣品須具有優(yōu)雅的外觀結構，較強的機械強度并且沒有出現任何塌陷和/或共晶融化，水分殘留要相對較低（1g水/100g 干物質），如果產品發(fā)生塌陷，不僅外觀不能接受，而且會導致樣品最終的水分含量較高，復水時間延長。

05產品玻璃化轉變溫度

為了確保干燥后蛋白具有長期穩(wěn)定性，非晶態(tài)成分（包含蛋白）的玻璃轉化溫度要高于計劃的儲存溫度。水是無定形相的增塑劑，需要保持較低的水分含量確保樣品的Tg 要高于運輸和儲存的最高溫度。

06產品塌陷溫度

一般來說，達到最終的目標，在整個凍干過程中，需要維持產品溫度在其玻璃轉化溫度以下。在干燥過程中，當冰晶升華時，對于非晶態(tài)樣品，產品溫度須維持在其塌陷溫度以下，塌陷溫度通常與熱致相變溫度（也就是最大凍結濃縮無定形相的玻璃態(tài)轉變溫度Tg’）一致，同時，也有必要維持產品溫度在任何晶體成分的共晶融化溫度以下。在實際中，這些溫度可以通過差示掃描量熱儀DSC或凍干顯微鏡來測定。在配方開發(fā)中有必要測定產品的塌陷溫度。

凍干顯微鏡Lyostat5及搭配使用的DSC模塊

為什么要測定塌陷溫度？

在低于產品的塌陷溫度下干燥是需要付出代價的，產品的溫度越低，干燥的速度越慢，干燥的成本就越高。通常，在-40℃以下干燥是不實際的，同時樣品能降低到的溫度還受一些物理條件的限制，比如凍干機的性能以及產品的配方。在配方開發(fā)過程中，藥物研發(fā)人員應該與工藝工程師（設計凍干工藝人員）緊密配合，并且清楚了解放大化生產型凍干機與實驗室研發(fā)凍干機的區(qū)別是非常重要的，通常情況下，生產型凍干機和實驗室凍干機在工藝參數控制方面會有所不同，一部分原因是生產型凍干機較大，在凍干過程中每瓶樣品的產品溫度差異較大。因此，如果對凍干過程熟悉的研發(fā)人員可以提供有用的信息幫助配方科學家做出正確的判斷，避免由于誤判導致將較好的配方排除在外。對于塌陷溫度較低的產品，也有一些方法，如可以通過控制過程參數來實現短時快速干燥。

配方設計需平衡蛋白穩(wěn)定性和塌陷溫度

很明顯，配方設計的一個目標是保證蛋白穩(wěn)定性的前提下提供較高的塌陷溫度，產品的塌陷溫度主要取決于配方的組成，如果蛋白的含量超過所有溶質的20%，會對Tg’有較大的的影響。盡管單純的蛋白溶液通常用DSC很難測出Tg’，根據實驗得出，增加蛋白含量，對于大多數的配方來說，均可以提高Tg’。通過外推法得到純的蛋白溶液的Tg’，大約為-10℃，遠遠高于大多數的單一賦形劑的Tg’(如蔗糖的Tg’為-32℃)，因此，從工藝過程的經濟角度考慮，更期望配方中較高的蛋白質和穩(wěn)定劑比例，然而，蛋白的穩(wěn)定性通常隨著穩(wěn)定劑與蛋白含量比例的增加而提高，因此須在高的塌陷溫度和較好的穩(wěn)定性方面做出平衡。并且，如下文討論的內容，隨著蛋白濃度的增加，蛋白質在預凍過程中抵抗凍結應力損傷的能力就會得到改善，那么在高蛋白濃度和高穩(wěn)定劑和蛋白重量比的情況下，穩(wěn)定性是最好的，這樣，就會導致整個配方較高的固形物濃度，給工藝帶來困難，總濃度超過10%的配方將比較難凍干。

如何改變Tg'？

在升華之前對配方進行一些處理可以改變Tg’，如經常使用的退火處理，在退火處理過程中，會從無定形相中移走一小部分成分，如使用甘氨酸作為晶體的填充劑，取決于預凍的方法，可能一部分的甘氨酸分子會保留在樣品的無定形相中，甘氨酸具有相對較低的Tg’(-42℃)，因此讓甘氨酸盡可能的結晶是非常重要的，這樣可以提高樣品中無定形相的Tg’，加快干燥，節(jié)省成本。對于賦形劑結晶，設計理想完善的方案，可以用DSC模仿凍結和退火工藝的條件來進行，這個方法可以參考Carpenter 和 Chang的文章內容。

實際上，從灌裝到最終干燥的產品復水，每一步均會對蛋白造成損傷，并且要求配方的成分能夠抑制蛋白的降解。

在快速處理步驟（如灌裝，預凍，干燥和復水等）中，主要的問題通常是物理損害，如低聚物的形成和/或蛋白沉淀；通常，蛋白從液體到固體的轉變，相對與減緩化學變化，更多的會減緩蛋白的物理變化的速率，因此，儲存過程中的化學降解經常是更嚴重的穩(wěn)定性問題。在儲存期間或復水時，蛋白也會發(fā)生聚合。在預凍和干燥過程中，受到凍結和干燥應力的作用，蛋白的結構很容易遭到破壞，如果在這些過程中，能夠抑制蛋白去折疊（變性），那么降解過程就會達到最小化，

因此，配方設計主要的關注點就是在這些過程中能夠保護蛋白，在干燥后的樣品中具有較高的Tg及較低的含水量，能阻止樣品內部發(fā)生化學反應，更好的保持蛋白的天然性能。

01在預凍過程中的蛋白的穩(wěn)定性

特定的蛋白是否易受冷凍破壞的影響取決于許多因素，除了在配方中包含適當的穩(wěn)定劑外。一般來說，會考慮三個很重要的參數：蛋白濃度，緩沖液的種類以及預凍方法。

蛋白濃度

增加蛋白質的濃度能夠提高蛋白對凍結變性的抵抗力，可以通過簡單地測定凍融后蛋白聚合的百分比，該百分比與蛋白質濃度呈反比。通常，如果預凍過程中去折疊的蛋白分子部分與濃度無關，那么預計增加蛋白濃度會增加蛋白聚合。然而，現在人們認為，增加蛋白質濃度會直接減少冷凍誘導的蛋白質去折疊。據推測，凍結階段的損傷包括蛋白在冰水界面的變性，假設只有有限數量的蛋白分子在這個界面變性，增加蛋白的初始濃度會導致較低比例的變性蛋白。處于實際的目的，將蛋白濃度作為一個重要的考慮因素，在配方開發(fā)過程中盡可能保持較高的濃度，就顯得特別簡單了。

緩沖液種類

緩沖液的選擇也是非常關鍵，主要引起問題的是磷酸鈉和磷酸鉀，在預凍和退火過程中，二者的pH值會有明顯的變化。對于磷酸鈉，其二元堿形式的容易結晶，導致在冷凍樣品中，剩余的無定形相中的pH會降到4或更低。對于磷酸鉀，其二氫鹽結晶后，pH會變到接近9.  pH改變的風險以及對蛋白的損害可以通過提高最初的冷卻速度，限制退火步驟的時間，降低緩沖液的濃度等來控制，所有這些措施可以降低鹽類結晶的機會?？焖倮鋬觯贿M行退火也限制了蛋白質在暴露在冷凍狀態(tài)下的時間。盡管其他的賦形劑能夠輔助抑制pH的改變，較好的方法是避免使用磷酸鈉和磷酸鉀。在預凍階段pH有較小變化的緩沖液包括檸檬酸鹽，組氨酸，Tris溶液等。

預凍方法

排除由于pH變化造成的問題，在實驗中發(fā)現，預凍過程中，蛋白質受破壞的程度跟冷卻的速率有關系，較快的冷卻速度形成的冰晶體較小，冰的比表面積越大，受破壞的程度越大，這個推測是由于蛋白在冰水界面變性導致。冷卻的速度通常受凍干機設備本身性能的限制，然而，一些對冷凍敏感的蛋白，即使慢速冷卻也會導致其變性。

02、在干燥和儲存過程中蛋白的穩(wěn)定性

盡管整個蛋白分子在預凍過程中保持了其原有的結構，然而，在后續(xù)的脫水干燥過程中如果不加入合適的穩(wěn)定劑也會面臨變性的風險。簡單的說，當去除蛋白分子的水合外層時，蛋白質天然的結構便遭到破壞。對多個蛋白的紅外光譜研究表明：無合適的穩(wěn)定劑存在時，在干燥的蛋白樣品中，其結構將會遭到去折疊。如果樣品迅速復水，損傷的程度（如，聚合百分比）與干燥蛋白質的紅外光譜的非天然表現直接相關。因此，降低復水后結構的破壞需要減小預凍和主干燥過程中蛋白結構的去折疊。而且，即使樣品立即復水后100%的天然蛋白分子被恢復，干燥的固體中也會有相當一部分去折疊的分子。在復水過程中分子內的再折疊可以主導分子間的相互作用，從而導致聚集，在復水后表現為100%的天然分子。

適當的賦形劑可以阻止或至少減輕蛋白結構的去折疊，配方是否成功可以通過紅外光譜檢查干燥后蛋白的二級結構來立即判斷，更重要的是，發(fā)表的一些研究顯示，干燥樣品的長期穩(wěn)定性取決于干燥過程中天然蛋白的保留量，如果干燥后的蛋白樣品存在結構上的去折疊，即使樣品在低于其Tg溫度以下儲存，蛋白也會很快被破壞，因此，紅外光譜法可作為蛋白配方的另外一種工具，研發(fā)人員可以在凍干后對樣品進行檢測，確定其結構是否遭到破壞。

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譯自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》  John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997

* 如有理解錯誤之處，還請參考原文

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