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黃曲霉毒素分析-HPLC檢測對比實(shí)驗(yàn)

一、介紹

黃曲霉毒素是由生活在熱帶或亞熱帶地區(qū)的黃曲霉,寄生曲霉和曲霉等微生物產(chǎn)生的一組霉菌毒素,具有強(qiáng)烈的致癌作用。據(jù)報(bào)道,經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素含量較高,超過食品安全機(jī)構(gòu)(如FDA)在各種食品(包括水果,豆類,谷物和香料)中規(guī)定的安全水平。

目前的法規(guī)要求總黃曲霉毒素(黃曲霉毒素B1,B2,G1和G2的總和)必須低于10μg/ kg。本次實(shí)驗(yàn)使用三氟乙酸(TFA)與HPLC結(jié)合熒光檢測的柱后衍生法進(jìn)行黃曲霉毒素分析。該方案可大大提高檢測黃曲霉毒素B1和G1的靈敏度。度除衍生方法外,多功能柱或免疫親和柱的使用可用于提高樣品制備過程中的再現(xiàn)性和回收率。

二、試驗(yàn)

●   常規(guī)HPLC

●   UHPLC

●   結(jié)構(gòu)體

黃曲霉毒素B1,B2,G1和G2是產(chǎn)生天然熒光的化合物。然而,B1和G1的熒光強(qiáng)度與B2和G2的熒光強(qiáng)度相比要小得多,因此,必須通過使用TFA衍生化從天然形式轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基化形式來提高黃曲霉毒素B1和G1分析的靈敏度。黃曲霉毒素B1,B2,G1和G2的結(jié)構(gòu)以及衍生的B1和G1的結(jié)構(gòu)如圖所示:


圖1.黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2和TFA衍生的B1和G1的結(jié)構(gòu)

●   Derivatizaton

黃曲霉毒素和實(shí)際樣品的標(biāo)準(zhǔn)混合物的TFA衍生化程序如圖所示:

圖2. TFA衍生化
* 1為了避免黃曲霉毒素吸附到容器內(nèi)壁上,必須用乙腈和Milli-Q水沖洗容器,然后干燥。

●   樣品制備

選擇玉米粗粉和烤花生作為測試樣品,并使用多功能柱用于玉米粗粒的樣品制備,而免疫親和柱用于制備烤花生。樣品制備程序如圖3所示。

1.玉米糠

2.烤花生

* 1在恢復(fù)估計(jì)試驗(yàn)中,將使用在重鉻酸鹽/ Milli-Q水(90/10)中的黃曲霉毒素(各自為0.5 11g / L)的標(biāo)準(zhǔn)混合物。
* 2多功能柱中有三種分離模式(反相,正相和離子交換)。(RomerLabs)
* 3免疫親和柱(HORIBA)利用抗黃曲霉毒素單克隆抗體和黃曲霉毒素之間的獨(dú)特結(jié)合能力。
* 4讓色譜柱平衡至室溫。小心地在上蓋上的孔上打孔,使空氣不會進(jìn)入凝膠,然后取上蓋和下蓋。
* 5用0.20克氯化鉀,0.20克磷酸二氫鉀,1.16克磷酸氫二鈉和8.0克氯化鈉(pH7.4)至1升配制Milli-Q水溶液。
* 6小心沖洗色譜柱,使空氣不會進(jìn)入凝膠。
* 7最大限度地減少乙腈中最終洗脫液的含水量。如果最終洗脫中的水含量相對較高,則消除溶劑需要更長的時(shí)間,這可能導(dǎo)致黃曲霉毒素的變性。
* 8完全從凝膠中釋放相互作用的黃曲霉毒素。


三、結(jié)果

黃曲霉毒素分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TFA衍生的黃曲霉毒素(各自為5.0μg/ L)的標(biāo)準(zhǔn)混合物的色譜圖如圖4所示[通過常規(guī)HPLC(上部),通過UHPLC(下部)]。通過常規(guī)HPLC在12分鐘內(nèi)完成分離,并在3.5分鐘內(nèi)通過UHPLC完成分離。

黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)混合物的線性范圍為0.5至10μg/ L,常規(guī)HPLC和UHPLC均具有優(yōu)異的相關(guān)性r2。

對于常規(guī)HPLC,在峰值保留時(shí)間和面積上分別具有優(yōu)于0.2%RSD和3%RSD的良好再現(xiàn)性,包括TFA衍生化程序(N = 6)。UHPLC還具有良好的重現(xiàn)性,峰值保留時(shí)間和面積分別具有優(yōu)于0.2%的RSD和3.5%的RSD。將1.0ug / L的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)混合物用于該估計(jì)。

圖4.黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)混合物的色譜圖(每種5.0μg/ L,TFA衍生化)1 =黃曲霉毒素G1,2 =黃曲霉毒素B1,3 =黃曲霉毒素G2,4 =黃曲霉毒素B2

使用樣品制備中的多功能柱(MycoSep 226AflaZon +)制備的玉米粗粒樣品的色譜圖顯示在圖5中(常規(guī)HPLC和UHPLC)。來自玉米粗粒的樣品和摻有黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)混合物的樣品用于黃曲霉毒素的恢復(fù)估計(jì)。在色譜圖中幾乎沒有觀察到污染物峰,并且對于常規(guī)HPLC和UHPLC都獲得了標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素的良好回收率,分析結(jié)果如表1所示。

在樣品制備中使用免疫親和柱(AFLAKING)制備的烤花生樣品的色譜圖顯示在圖6中(常規(guī)HPLC和UHPLC)。來自烤花生的樣品和摻有黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)混合物的樣品用于黃曲霉毒素的恢復(fù)估計(jì)。在色譜圖中幾乎沒有觀察到污染物峰,并且對于常規(guī)HPLC和UHPLC都獲得了標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素的良好回收率,分析結(jié)果如表2所示。

圖5.來自玉米粒的純化溶液的色譜圖1 =黃曲霉毒素G1,2 =黃曲霉毒素B1,3 =黃曲霉毒素G2,4 =黃曲霉毒素B2

圖6.來自烤花生的純化溶液的色譜圖1 =黃曲霉毒素G1,2 =黃曲霉毒素B1,3 =黃曲霉毒素G2,4 =黃曲霉毒素B2

表1.標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素的回收率[%]