制備型反相高效液相色譜 (HPLC) 可分離高純度化合物,被廣泛應用于化學、制藥、生物技術和生物化學行業(yè)。由于其分離純度高,在小分子藥物化合物、寡核苷酸、多肽、天然產物的藥物合成中成為必不可少的純化手段。
圖1:HPLC純化在藥物中的案例
HPLC餾分是什么?
HPLC餾分是含有水和極性有機溶劑(如乙腈/水或甲醇/水),為了更好的分離雜質,反向HPLC流動相中通常會添加0.1%三氟乙酸(TFA)。
1、HPLC餾分濃縮面臨的問題
藥物發(fā)現(xiàn)中,為了建立文庫或通過高通量篩選確定合適的靶標,藥物合成后需要進行大量純化、篩選、分析工作,每天需要處理大量的HPLC餾分,前處理所花費的時間高達61%。
處理HPLC餾分濃縮時可能出現(xiàn)的瓶頸:
1. 藥物種類多變,樣品體積、樣品容器、溶劑比例不一;
2. 樣品量巨大,處理時間長;
3. 甲醇/乙腈的沸點較低,在蒸發(fā)過程容易產生暴沸;
4. 直接濃縮干燥很難得到干燥蓬松的最終產物。
2、提升效率的關鍵點
新藥研發(fā)就是與時間賽跑,提高效率就是節(jié)省金錢。
因此,提高樣品平行濃縮的效率,就必須解決樣品前處理中高通量和自動化的問題,在藥物發(fā)現(xiàn)CRO企業(yè)中尤為重要。
高通量
為滿足藥物高通量篩選要求,Genevac HT-12高端智能的蒸發(fā)系統(tǒng)提供高通量處理量,同時處理上百個到上千個樣品,上百種轉子可選,滿足各類化合物體積不一和高通量的濃縮需求。
轉子類型 |
HT-12 樣品通量 |
EZ-2 4.0 樣品通量 |
深孔板 |
24*96 |
4*96 |
淺孔板 |
48*96 |
8*96 |
50ml燒瓶 |
48 |
8 |
50ml離心管 |
120 |
20 |
4ml小瓶 |
288 |
48 |
16×100mm 試管 |
288 |
48 |
13×100mm 試管 |
480 |
80 |
1.5mlEP管 |
384 |
64 |
樣品完整性
現(xiàn)代藥物化學中,保持樣品的質量和完整性非常重要。Dri-pure防暴沸技術,利用梯度真空和高轉速的原理,有效防止低沸點溶劑暴沸,避免樣品交叉污染。(點擊查看往期內容:實力解析:如何防止混合溶劑“碰撞”導致的樣品損失)
自動化
以下是實驗室一般處理流程及Genevac的處理流程的對比圖——
Genevac通過SampleGenie技術簡化實驗流程,直接將樣品濃縮到小瓶中,避免樣品轉移帶來的損失,并可以節(jié)約濃縮時間,以方便后續(xù)處理。
圖2:實驗室一般處理流程
圖3:Genevac處理流程簡化方案
3、如何從HPLC餾分中高效得到干燥蓬松的最終產物?
藥物研發(fā)實驗室的要求是將樣品干燥成蓬松的粉末狀,以便準確稱量樣品、二次取樣、復溶和儲存,因此,冷凍干燥是實驗的理想技術。但是常規(guī)的冷凍干燥系統(tǒng)一方面處理時間長,另一方面難以處理有機溶劑,因為有機溶劑很容易產生暴沸,并因此損壞真空泵,造成樣品損失。而使用傳統(tǒng)的蒸發(fā)技術難以得到蓬松的樣品。
LyoSpeed?技術
快速凍干法(LyoSpeed?)是一個兩全其美的方法:一種快速,能夠得到徹底干燥和蓬松樣品的方法。該方法同時也適用于難以干燥的樣品,尤其適用HPLC餾分干燥。利用先濃縮后凍干的程序,蒸發(fā)程序包含以下階段:
1) 使用Dri-pure防暴沸技術& 40mbar的壓力下去除部分大部分有機溶劑;
2) 自動排液放出有機溶劑(ADD冷阱自動排液功能);
3) 真空度降至8mbar,快速蒸發(fā)大部分水;
4) 關閉紅外燈,極低的真空度下使樣品冷凍變成固態(tài);
5) 在全真空下加熱一定時間以加速升華;
6) 最后在全真空不加熱的條件下直至樣品完全冷凍干燥。
圖4:快速凍干過程
Lyospeed法比只用凍干的方法速度更快,同時比只用蒸發(fā)的方法得到更加干燥和蓬松的樣品。
4、案例分享
將15ml 0.01M 布洛芬鈉鹽溶液溶解在40%乙腈水混合物中并裝入20ml閃爍瓶,使用Lyospeed技術平衡濃縮和凍干過程,在HT系列溶劑蒸發(fā)工作站進行快速凍干。下圖顯示傳統(tǒng)離心濃縮樣品與快速凍干樣品之間的差異,快速凍干的樣品更加蓬松,更利于樣品的復溶。
圖5:傳統(tǒng)蒸發(fā)結果
圖6:快速凍干結果
Lyospeed技術兼容EZ-2 4.0 Elite離心濃縮系統(tǒng)和Genevac HT 3i系列溶劑蒸發(fā)工作站,由足夠好的無油真空泵、自動除霜和排液的冷阱以及一個靈活、可編輯方法的軟件組成。
EZ-2 4.0 Elite離心濃縮系統(tǒng)
HT 3i系列溶劑蒸發(fā)工作站
參考文獻:
Genecac_TechArticle_Drying of Problematic Purification Samples by Lyophilisation in a Centrifugal Evaporator - with “Fluffy” Results